Structural and biochemical investigation of human collagen lysyl hydroxylases

Collagen biosynthesis is an intricate pathway which requires multiple post-translational modifications (PTMs) essential for the generation of mature, triple-helical molecules. Among the PTMs, the most important are specific collagen lysine modifications which occur in the endoplasmic reticulum at very initial stages of collagen biogenesis. Lysines are subsequentily hydroxylated and glycosylated, which serves as site for the formation of extracellular cross-links, leading to fibrillary or meshwork superstructures in the extracellular matrix (ECM). Enzymes belonging to the family of collagen lysyl hydroxylases (LH or PLOD) catalyze lysine hydroxylation of collagens using Fe2+, 2-oxoglutarate (2-OG), ascorbate and molecular oxygen. In humans, PLOD genes encode for three LH enzyme isoforms: LH1, LH2a/b, and LH3, respectively. Differently from LH1 and LH2a/b, LH3 also displays glycosyltransferase activity, used to further modify collagen performing a specific O-linked conjugation of galactose to hydroxylysines (GalT activity), followed by conjugation of glucose to galactosyl-5-hydroxylysines (GlcT activity), using Mn2+ as cofactor. Here, we presented the crystal 3D structures of full-length human LH3 in complex with cofactors and donor substrates. The elongated homodimeric LH3 architecture shows two distinct catalytic sites: the GT domain at the N-terminus and the LH domain at the C-terminus of each monomer, separated by an accessory domain. The GT domain displays both galactosyl- and glucosyl transferase activities, and it also bears distinguishing features compared to other known glycosyltransferases. Various disease-related mutations map in close proximity to the catalytic sites altering the stability of LH3 and/or its normal enzymatic activity. Further, we used structure-based mutagenesis to investigate the broad cooperative network of amino acids in the GT domain. We identified critical “hot spots” leading to selective loss of the GalT activity without affecting the GlcT activity, providing insights into the enzymatic reaction mechanism.We also presented molecular structures of LH3 in complex with UDP-sugar analogs, where the sugar moiety is visible for the first time, thus providing the first structural templates for LH3 glycosyltransferase inhibitors development. The main aim of this PhD work centered around the structural and biochemical characterization of human LH3 isoform. The results collected were instrumental also for elucidating molecular features associated to other related human LH isoforms. My primary activity included the elucidation of the LH3 biochemical features, and the inference of their significance at the structural level. Also, I developed and standardized the protocols for enzymatic characterization of the enzyme. These methods allowed me to investigate the multiple activities of LH3 in vitro. Collectively, site-directed mutagenesis coupled with enzymology studies allowed defining a comprehensive framework of the complex LH and GT features of LH3, therefore stimulating further studies aiming at elucidating the comprehensive biological significance of this complex multifunctional molecule.

La biosintesi del collagene è un percorso intricato che richiede più modifiche post-traduzionali (PTM) essenziali per la generazione di molecole mature a tripla elica. Tra le PTMs, le più importanti sono le modificazioni dei residui di lisina che si verificano nel reticolo endoplasmatico nelle fasi iniziali della biogenesi del collagene. Le lisine vengono inizialmente idrossilate e successivamente glicosilate, le lisine modificate fungono poi da siti per la formazione di legami incrociati extracellulari, che portano a sovrastrutture fibrillari o reticolari nella matrice extracellulare (ECM). Enzimi appartenenti alla famiglia delle lisil idrossilasi (LH o PLOD) del collagene catalizzano l'idrossilazione dei residui di lisina utilizzando Fe2+, 2-ossoglutarato (2-OG), ascorbato e ossigeno molecolare. Negli esseri umani, i geni PLOD codificano per tre isoforme dell'enzima LH: LH1, LH2a/b ed LH3, rispettivamente. A differenza di LH1 e LH2a/b, LH3 mostra anche attività glicosiltransferasica, utilizzata per modificare ulteriormente il collagene eseguendo una specifica coniugazione O-linked di galattosio con idrossilisina (attività GalT), seguita dal trasferimento di una molecola di glucosio sulla galattosil-5-idrossilisina (attività GlcT), usando Mn2+ come cofattore. Qui, abbiamo presentato le strutture tridimensionali di LH3 umano in complesso con cofattori e substrati donatori. L'architettura omodimerica e allungata di LH3 presenta due siti catalitici distinti: il dominio GT all'estremità N e il dominio LH all'estremità C di ciascun monomero, separati da un dominio accessorio. Il dominio GT mostra attività sia galattosil che glucosil transferasica; inoltre presenta anche caratteristiche distintive rispetto ad altre glicosiltransferasi note. Varie mutazioni correlate a malattie del tessuto connettivo mappano in stretta prossimità dei siti catalitici, nella maggior parte dei casi queste alterano la stabilità di LH3 e la sua normale attività enzimatica che correla con l’insorgenza della patologia. Inoltre, abbiamo utilizzato la mutagenesi basata sulla struttura per studiare l'ampia rete cooperativa di amminoacidi nel dominio GT. Questa rete include anche l'ambiente del primo guscio del sito catalitico GT che condivide alcune caratteristiche proprie di glicosiltransferasi con meccanismo di ritenzione e di inversione. Abbiamo così potuto identificare "punti caldi" critici che portano alla perdita selettiva dell'attività galactosiltransferasica senza influire su quella glucosiltransferasica, fornendo informazioni sul meccanismo di reazione enzimatica. Infine, Abbiamo anche presentato strutture molecolari di LH3 in complesso con analoghi di UDP-zuccheri, dove la porzione dello zucchero è visibile per la prima volta, fornendo così i primi modelli strutturali per lo sviluppo di inibitori delle attività GT possedute da LH3. L'obiettivo principale di questo lavoro di dottorato è incentrato sulla caratterizzazione strutturale e biochimica dell'isoforma umana di LH3. I risultati raccolti sono stati strumentali anche per chiarire le caratteristiche molecolari associate alle altre isoforme umane di LH1 ed LH2. La mia attività principale includeva la delucidazione delle caratteristiche biochimiche dell'LH3 e l'inferenza del loro significato a livello strutturale. Inoltre, ho sviluppato e standardizzato i protocolli per la caratterizzazione enzimatica di LH3. Questi metodi mi hanno permesso di studiare le molteplici attività di LH3 in vitro. Collettivamente, la mutagenesi sito-diretta accoppiata con studi enzimologici ha permesso di definire un quadro completo delle complesse caratteristiche dell’attività LH e GT di LH3, promuovendo quindi ulteriori studi volti a chiarire il significato biologico completo di questa complessa molecola multifunzionale.