Stress cellulare mediato dalle nanoplastiche: implicazioni per la funzione neuroimmune e l’omeostasi cellulare.

ABSTRACT The rapid increase in global plastic production has resulted in the widespread environmental distribution of nanoplastics (NPs), raising significant concerns regarding their potential impacts on human health. Despite growing evidence of their biological persistence, mechanistic basis by which NPs impact cellular function remains insufficiently understood. This thesis investigates the cellular and molecular responses to polystyrene NPs across multiple human cell models, Neuroblastoma (SH-SY5Y), immune (THP-1, macrophages), human gingival fibroblast (hGF), colorectal adenocarcinoma (Caco-2), and osteoblastic (MG-63) cells were employed to systematically evaluate size- and concentration-dependent effects of NPs exposure. Cellular responses were characterized using immunocytochemistry, inflammatory cytokine profiling, mitochondrial and ER stress analysis, ROS, and cytotoxicity assays. NPs exposure promoted persistent intracellular retention accompanied by lysosomal dysfunction, impaired autophagic flux, ER stress, and constrained mitochondrial function, collectively indicating a sublethal multi-organelle stress response. Macrophages exhibited high vulnerability consistent with their phagocytic nature and inflammatory modulation with cytokine release, while inflammatory stimuli further enhanced NPs uptake and intracellular persistence. In contrast, neuronal cells display limited extracellular cytokine secretion yet accumulated intracellular IL-1β, suggesting a low-grade inflammatory activation, and size dependent NPs uptake. These responses were further recapitulated in primary cortical neurons, supporting the translational relevance of the findings across neuronal systems. Across all cell lines, NPs exposure primarily induced functional impairments rather than acute cytotoxicity. Cell viability remained largely preserved, in all cells with LDH measurements indicating minimal membrane damage. Cell migration assay revealed delayed wound closure, indicative of impaired cellular migration and proliferative capacity on NPs exposure. This phenomenon was more evident in fibroblasts and MG-63 cells, whereas Caco-2 cells exhibited a NPs size-dependent response. Transmission electron microscopy confirmed intracellular localization of NPs within membrane-bound vesicles, consistent with endocytic uptake, while NPs exposure disrupted the cellular architecture in cell specific manners. Particle internalization was more prominent for smaller NPs, whereas larger particles demonstrated comparatively limited cellular uptake. Differential cytokine expression patterns highlighted a pronounced proinflammatory tendency, particularly involving IL-1β-driven signaling pathways. Collectively, this work provides mechanistic evidence that NPs act as drivers of cellular stress, disrupting fundamental physiological processes with significant implications for cellular integrity. The cumulative nature of these observations suggests that NPs exposure may contribute to previously unrecognized accumulation-related pathologies. In this context, we propose the term ‘plasticoma’ to describe the preferential deposition of NPs in tissues, positioning intracellular persistence as a potential determinant of long-term cellular dysfunction. By bridging environmental exposure with molecular outcomes, this thesis advances current understanding of NPs toxicity and underscores the urgent need for strategies aimed at limiting biological accumulation and mitigating human exposure to emerging particulate pollutants.

Il rapido aumento della produzione globale di plastica ha determinato un’ampia diffusione ambientale delle nanoplastiche (NPs), suscitando crescenti preoccupazioni riguardo ai loro potenziali effetti sulla salute umana. Nonostante le evidenze della loro persistenza biologica, i meccanismi attraverso cui le NPs influenzano la funzione cellulare rimangono ancora poco definiti. La presente tesi analizza le risposte cellulari e molecolari alle nanoplastiche di polistirene mediante diversi modelli cellulari umani. Cellule di neuroblastoma (SH-SY5Y), cellule immunitarie (THP-1 e macrofagi), fibroblasti gengivali umani (hGF), cellule di adenocarcinoma colorettale (Caco-2) e cellule osteoblastiche (MG-63) sono state impiegate per valutare sistematicamente gli effetti dell’esposizione alle NPs in relazione a dimensione e concentrazione. Le risposte cellulari sono state caratterizzate tramite immunocitochimica, analisi delle citochine infiammatorie, valutazione dello stress mitocondriale e del reticolo endoplasmatico, misurazione delle specie reattive dell’ossigeno (ROS) e saggi di citotossicità. L’esposizione alle NPs ha determinato una persistente ritenzione intracellulare associata a disfunzione lisosomiale, alterazione del flusso autofagico, stress del reticolo endoplasmatico e riduzione della funzione mitocondriale, indicando una risposta di stress subletale multi-organello. I macrofagi hanno mostrato maggiore vulnerabilità, coerente con la loro natura fagocitica e con il rilascio di citochine, mentre gli stimoli infiammatori hanno ulteriormente aumentato l’assorbimento e la persistenza intracellulare delle NPs. Al contrario, le cellule neuronali hanno evidenziato una limitata secrezione extracellulare di citochine ma un accumulo intracellulare di IL-1β, suggerendo un’attivazione infiammatoria di basso grado e un assorbimento dipendente dalla dimensione delle particelle; risultati analoghi sono stati osservati nei neuroni corticali primari. In tutte le linee cellulari, l’esposizione alle NPs ha indotto prevalentemente alterazioni funzionali piuttosto che citotossicità acuta. La vitalità cellulare è rimasta ampiamente preservata e le misurazioni della lattato deidrogenasi (LDH) hanno indicato un danno minimo della membrana. I saggi di migrazione cellulare hanno mostrato un ritardo nella chiusura della ferita, indicativo di una ridotta capacità migratoria e proliferativa, effetto più evidente nei fibroblasti e nelle cellule MG-63, mentre le cellule Caco-2 hanno presentato una risposta dipendente dalla dimensione delle particelle. La microscopia elettronica a trasmissione ha confermato la localizzazione intracellulare delle NPs in vescicole delimitate da membrana, coerente con meccanismi di endocitosi, evidenziando alterazioni dell’architettura cellulare specifiche per ciascun tipo cellulare. L’internalizzazione è risultata più marcata per le NPs di dimensioni minori, mentre quelle più grandi hanno mostrato un assorbimento limitato. I pattern di espressione citochinica hanno inoltre evidenziato una tendenza proinfiammatoria, in particolare attraverso vie di segnalazione guidate da IL-1β. Complessivamente, il lavoro fornisce evidenze meccanicistiche del ruolo delle NPs nell’induzione di stress cellulare e nell’alterazione di processi fisiologici fondamentali. La natura cumulativa di tali osservazioni suggerisce che l’esposizione alle NPs possa contribuire a patologie da accumulo finora poco riconosciute. In questo contesto, viene proposto il termine “plasticoma” per descrivere la deposizione preferenziale delle NPs nei tessuti, indicando la persistenza intracellulare come possibile determinante di disfunzione cellulare a lungo termine. Collegando l’esposizione ambientale agli esiti molecolari, la tesi contribuisce ad ampliare la comprensione della tossicità delle nanoplastiche e sottolinea la necessità di strategie volte a limitarne l’accumulo biologico e l’esposizione umana.