Il recettore lectinico CD93 nelle piastrine del sangue: un nuovo attore nella trombosi e nell'immunità

The C-type lectin receptor CD93 is a single pass type I transmembrane glycoprotein involved in inflammation, immunity, and angiogenesis. This study investigates the role of CD93 in platelet activation induced by thrombotic and septic stimuli. Thrombin, TRAP4, thromboxane A2 analogue U46619, ADP, convulxin, collagen and C-type CpG ODNs (ODN2395) were selected as platelet agonists in this study and their effect on control wild type (WT) and CD93-knockout (KO) murine platelets was investigated. Platelet activation and aggregation were investigated by flow cytometry and light transmission aggregometry, respectively. Protein phosphorylation was analyzed by immunoblotting. Subcellular localization of PAR4 receptor was investigated by wide-field and confocal microscopy. CD93 expression and subcellular localization was assessed in both human and murine platelets by flow cytometry. CD93 was expressed on the surface of human and murine platelets and was found almost two-time more abundant in immature platelet fraction. Most CD93 was localized in the cytosolic compartment and moved to the plasma membrane upon platelet activation. The lack of CD93 in mice was not associated to any evident bleeding defect nor with any alteration in the ability of platelets to adhere to collagen or fibrinogen. No alterations of platelet activation were observed upon stimulation with U46619, ADP, convulxin, and collagen. Conversely, platelet aggregation induced by stimulation of the thrombin receptor PAR4 was significantly reduced in the absence of CD93. This defect was associated to a significant reduction of α-granule secretion, integrin αIIbβ3 activation, and protein kinase C stimulation. Resting WT and CD93-deficient platelets expressed comparable amounts of PAR4. However, upon stimulation with a PAR4 activating peptide, a more pronounced clearance of PAR4 from the platelet surface was observed in CD93-deficient platelets compared to WT controls. Confocal microscopy analysis revealed a massive movement of PAR4 into cytosolic compartments of activated platelets lacking CD93. Accordingly, platelet desensitization following PAR4 stimulation was more pronounced in CD93 KO platelets compared to WT controls. Furthermore, CD93 KO platelets exhibited a significant impairment in α-granule secretion induced by stimulation with CpG ODNs, whereas integrin αIIbβ3 activation and platelet aggregation were not affected. Immunoblotting analysis revealed that CpG ODNs stimulated the tyrosine phosphorylation of different signalling proteins in WT platelets, including PLCγ2 and Pyk2. These responses were significantly defective in the absence of CD93. Moreover, activation of Akt and the MAP kinases cascade by CpG ODNs were markedly dependent on CD93 expression. Altogether, these data outline a dual role of the platelet receptor CD93 in thrombosis and immunity. These results demonstrate that CD93 supports platelet activation triggered by PAR4 stimulation and is required to stabilize the expression of the thrombin receptor on the cell surface. Furthermore, during infection, CD93 is involved in platelet α-granule secretion induced by CpG ODNs by regulating the activation of protein kinase-dependent pathways.

CD93 è una glicoproteina transmembrana di tipo I coinvolta nell'infiammazione, nell'immunità e nell'angiogenesi. Questo studio indaga il ruolo di CD93 nell'attivazione piastrinica indotta da agonisti trombotici e settici. Per questo studio sono stati selezionati i seguenti agonisti: trombina, TRAP4, l’analogo del trombossano A2 U46619, ADP, convulxina, collagene e CpG ODN di tipo C (ODN2395) ed è stato valutato il loro effetto sulle piastrine murine di controllo wild type (WT) e CD93-knockout (KO). L'attivazione e l'aggregazione piastrinica sono state studiate rispettivamente mediante citometria a flusso e aggregometria. La fosforilazione delle proteine è stata analizzata mediante immunoblotting. La localizzazione subcellulare del recettore PAR4 è stata studiata mediante microscopia ottica e confocale. L'espressione di CD93 e la localizzazione subcellulare sono state valutate sia nelle piastrine umane che murine mediante citofluorimetria. CD93 è espresso sulla superficie di piastrine umane e murine e la sua espressione raddoppia nella frazione piastrinica immatura. La maggior parte del recettore è localizzato nel compartimento intracellulare e trasloca sulla membrana plasmatica dopo l'attivazione piastrinica. La mancanza di CD93 nei topi non era associata ad alcun evidente difetto emorragico né ad un'alterazione della capacità delle piastrine di aderire al collagene e al fibrinogeno. Non sono state osservate alterazioni dell'attivazione piastrinica dopo stimolazione con U46619, ADP, convulxina e collagene. Al contrario, l'aggregazione piastrinica indotta dalla stimolazione del recettore della trombina PAR4 era significativamente ridotta in assenza di CD93. Questo difetto è stato associato a una significativa riduzione della secrezione di α-granuli, dell’attivazione dell’integrina αIIbβ3 e della stimolazione della protein chinasi C. Le piastrine WT e CD93 KO quiescenti esprimevano quantità comparabili di PAR4. Tuttavia, dopo la stimolazione con il peptide attivante PAR4, è stata osservata una clearance più pronunciata di PAR4 dalla superficie delle piastrine carenti di CD93 rispetto ai controlli WT. L'analisi al microscopio confocale ha rivelato una massiccia traslocazione di PAR4 nei compartimenti citosolici delle piastrine attivate prive di CD93. Di conseguenza, la desensitizzazione piastrinica in seguito alla stimolazione di PAR4 era più pronunciata nelle piastrine CD93 KO rispetto ai controlli WT. Inoltre, le piastrine CD93 KO mostravano una significativa compromissione della secrezione di α-granuli indotta dalla stimolazione con CpG ODN, mentre l'attivazione dell’integrina αIIbβ3 e l'aggregazione piastrinica non sono state influenzate. L'analisi immunoblotting ha rivelato che i CpG ODN stimolavano la fosforilazione della tirosina di diverse proteine di segnalazione nelle piastrine WT, tra cui PLCγ2 e Pyk2. Queste risposte erano significativamente difettose in assenza di CD93. Inoltre, l'attivazione di Akt e della cascata delle MAP chinasi da parte dei CpG ODN erano fortemente dipendenti dall'espressione di CD93. Nel loro insieme questi risultati definiscono un duplice ruolo del recettore piastrinico CD93 nella trombosi e nell'immunità. Questi risultati dimostrano che CD93 supporta l'attivazione piastrinica innescata dalla stimolazione di PAR4 ed è necessario per stabilizzare l'espressione del recettore della trombina sulla superficie cellulare. Inoltre, durante l’infezione, CD93 è coinvolto nella secrezione piastrinica di α-granuli indotta da CpG ODN regolando l'attivazione delle vie di segnalazione dipendenti dalle protein chinasi.