The crosstalk between NuMA and multiple mitotic partners instructs division orientation in mammalian cells

Mitotic progression sustains tissue morphogenesis and homeostasis supporting faithful segregation of the genetic material and correct positioning of the daughter cells within the tissue. The mitotic spindle is the main actor coordinating cell division, and what defines the position and orientation of the mitotic spindle have been object of intense investigation. Several pathways have been involved in establishing correct spindle orientation impinging on the evolutionarily conserved Gai/LGN/NuMA complexes. During mitosis, the pool of cortical trimeric complexes orients the spindle by generating pulling forces on astral microtubules (MTs), via direct interaction of NuMA with the minus-end-directed MT motors dynein/dynactin. However, the exact mechanism by which MTs and dynein/dynactin are recruited and organized at the mitotic cell cortex still remains elusive. Dynactin is a multisubunit complex that increases dynein processivity by forming a stable complex in the presence of activating adaptors via the hook domain in Hook-family effectors, or a coiled-coil segment in CC1-box-containing effectors. The research activities of my PhD revealed that the N-terminal region of NuMA spanning residues 1-705 directly contacts both mitotic isoforms of dynein light intermediate chains (LIC1/2). This binding is mediated by the LIC C-terminal a1-helix analogously to what described for other known dynein/dynactin activating adaptors. Crystallographic studies showed that NuMA1-153 folds as a hook domain that contacts LIC1/2. However, biochemical analyses showed that this region does not recapitulate entirely the NuMA/dynein interface. Interestingly, sequence alignments between NuMA orthologues and CC1-box-containing adaptors suggested the presence of a second binding site in the N-terminal portion of the NuMA coiled-coil, named the CC1-box-like motif and demonstrated important for the NuMA/LIC binding. Pull-down experiments showed that a double-mutant in the CC1-box-like motif impairs NuMA binding to LIC. Importantly, orientation rescue experiments conducted with NuMA truncation mutants lacking either of the LIC-binding interfaces showed that in HeLa cells both NuMA motifs are essential for proper spindle assembly and mitotic progression. These evidences support the notion that NuMA acts as a mitotic dynein/dynactin adaptor, forming a complex with two dynein motors and one dynactin. The organization of dynein motors at the cortex is orchestrated by NuMA interactions with LGN.

La mitosi sostiene i processi di mantenimento della morfogenesi e omeostasi dei tessuti, assicurando una corretta segregazione del materiale genetico tra le due cellule figlie e il loro posizionamento all’interno dei tessuti. Il fuso mitotico è il principale elemento che coordina la divisione cellulare e, dunque, i meccanismi di orientazione del fuso sono continuamente oggetto di studio. Diversi pathway contribuiscono a mantenere il corretto posizionamento del fuso mitotico, la maggior parte dei quali coinvolge complessi molecolari evolutivamente conservati costituiti dalle proteine Gai/LGN/NuMA. Durante la mitosi, parte di questi complessi localizzano nelle regioni corticali sovrastanti i poli, dove l’interazione tra NuMA e le proteine motrici associate ai microtubuli dineina e dinactina permette l’orientamento del fuso mitotico generando forze di trazione sui microtubuli astrali. Tuttavia, i meccanismi molecolari che determinano il reclutamento e l’organizzazione dei microtubuli e dei motori molecolari dineina e dinactina alla membrana della cellula mitotica risultano ancora poco chiari e caratterizzati. Il complesso multi-subunità dinactina aumenta la processività del movimento verso le estremità minus dei microtubuli della proteina dineina e forma con quest’ultima un complesso stabile, grazie alla presenza di proteine adattatrici contenti un dominio hook o, all’interno di un segmento coiledcoil, una CC1-box. Durante il mio dottorato l’attività di ricerca svolta ha dimostrato che la regione N-terminale di NuMA, comprendente i residui 1-705, lega entrambe le isoforme mitotiche delle catene intermedie leggere della dineina (LIC1/2). L’interazione è mediata dall’elica a1 presente al C-terminale di LIC, come è stato caratterizzato in letteratura per diverse proteine adattatrici del complesso dineina/dinactina. Studi cristallografici hanno dimostrato che NuMA1-153 adotta una conformazione tipica del dominio hook che interagisce direttamente con LIC1/2. Tuttavia, saggi biochimici in vitro hanno rivelato che questa regione non ricapitola l’interfaccia di legame NuMA/dineina. Successivi allineamenti di sequenza tra gli ortologhi di NuMA e le proteine adattatrici contenenti il motivo CC1-box ci ha suggerito la possibile presenza di una seconda interfaccia di legame NuMA/dineina all’interno del coiled-coil di NuMA, che abbiamo chiamato CC1-box-like. Ulteriori saggi in vitro hanno dimostrato che un doppio mutante nella regione CC1-box-like di NuMA è incapace di interagire con LIC. Inoltre, esperimenti in cellule HeLa di ripristino del corretto orientamento del fuso mitotico hanno confermato che entrambe le interfacce di legame NuMA/dineina risultano essenziali per un corretto assemblaggio del fuso mitotico e completamento della mitosi. Questi risultati ci hanno portato a stabilire che NuMA agisce da proteina adattatrice per la formazione di un complesso in cui sono necessarie due molecole di dineina e una di dinactina. Inoltre, il complesso di NuMA con la dineina sui microtubuli astrali del fuso mitotico è ancorato alle regioni corticali grazie all’interazione con la proteina LGN.