Biochemical and structural studies on Monoamine Oxidases and UPD-Glucuronic acid 4- epimerase

My doctoral thesis describes the work carried out in the Structural Biology laboratory at University of Pavia, under the supervision of Prof. Mattevi Andrea and Prof. Binda Claudia. The core of my research activities was the study of two enzymes by a combination of X-ray crystallography and enzymology approaches: the human biomedical target Monoamine Oxidase (MAO; Chapter 1) and the biocatalytically-relevant UDP-Glucuronic acid 4-epimerase (BcUGAepi; Chapter 2). Along the thesis, the Chapters will mainly summarize the results achieved during my PhD and their scientific implications, while a detailed analysis of the experimental work is reported in the articles attached at the end of each Chapter. The work on MAOs was organized in three distinct projects that are described in sections 1.2, 1.3 and 1.4. Human Monoamine Oxidases A and B (MAO-A and MAO-B) are mitochondrial enzymes involved in the regulation of catecholamines and other biogenic amines. They have been widely studied for their role in neurological diseases but, in the last years, an increasing number of studies highlighted the involvement of MAO-A and hydrogen peroxide (secondary product of oxidases during the catalytic turnover) in heart diseases and cardiac senescence. The aim of the project was the biochemical characterization of engineered “oxygen inert” variants of human MAO-A, which were concomitantly tested in cellular studies by the group of Prof. Angelo Parini at the Institute of Metabolic and Cardiovascular Diseases (Toulouse, France) to probe their effects on ageing mechanisms. The aim of this project was to explore the correlation of altered enzyme levels, imbalanced metabolism, and reactive oxygen species (ROS) generation with mitochondrial damage, cell degeneration, and ageing. Human MAOs are established neurological targets and many studies are focused on the development of new and selective MAO-A and MAO-B inhibitors. In collaboration with Prof. Stanislav Gobec at the University of Ljubljana (Slovenia) and his team, we studied a new class of MAOs inhibitors with the general scaffold of 1-propargyl-4-styrylpiperidines. Based on cis/trans stereoisomers we aimed at selectively targeting the two isoforms of the MAOs. Interestingly, while the cis isomers have shown MAO-A selectivity, the trans analogues were potent MAO-B inhibitors. The reaction mechanism of these compounds was studied by kinetic analysis, UV-Vis spectrum measurements and X-ray crystallography. This represented a unique case of stereoselective activity of cis/trans isomers able to discriminate between structurally related enzyme isoforms. Diphenylene iodonium (DPI) is a potent inhibitor of a large number of heme- and flavoenzymes, widely employed in cellular experiments as a probe for ROS-depending processes. In our laboratory, we performed a structural and biochemical analysis of DPI with both MAO-A and MAO-B, as these enzymes play an active role in ROS systems. We proved that DPI is a reversible and competitive inhibitor of both isoforms of MAOs, these findings should be carefully considered whenever DPI is used as a modulator of ROS signalling and oxidative stress.

La mia tesi di dottorato descrive il lavoro svolto presso il laboratorio di Biologia Strutturale dell'Università degli Studi di Pavia, sotto la supervisione del Prof. Mattevi Andrea e della Prof. Binda Claudia. Il fulcro delle mie attività di ricerca è stato lo studio di due enzimi mediante l’utilizzo della cristallografia a raggi X: il target di interesse biomedico Monoamino Ossidasi umane (MAO; Capitolo 1) e l’UDP Glucuronic acid 4-epimerase, la cui reazione è oggetto di studio per l’utilizzo nei processi di biocatalisi (BcUGAepi; Capitolo 2). I vari capitoli della tesi riassumeranno principalmente i risultati raggiunti durante il mio dottorato di ricerca e le loro implicazioni scientifiche, mentre un'analisi dettagliata del lavoro sperimentale è riportata negli articoli allegati alla fine di ogni capitolo. Il lavoro sulle MAO è stato organizzato in tre progetti distinti descritti nelle sezioni 1.2, 1.3 e 1.4. Le monoammine ossidasi umane A e B (MAO-A e MAO-B) sono enzimi mitocondriali coinvolti nella regolazione delle catecolamine e di altre ammine biogene. Sono stati ampiamente studiati per il loro ruolo nelle malattie neurologiche ma, negli ultimi anni, un numero crescente di studi ha evidenziato il coinvolgimento di MAO-A e perossido di idrogeno (prodotto secondario delle ossidasi generato durante il turnover catalitico) nelle malattie cardiache e nella senescenza cardiaca. Lo scopo del progetto è stata la caratterizzazione biochimica di varianti ingegnerizzate della MAO-A umana inerti all’ossigeno, che sono state testate anche in studi cellulari dal gruppo del Prof.Angelo Parini presso l'Istituto di malattie metaboliche e cardiovascolari (Tolosa, Francia) per sondarne gli effetti sui meccanismi di invecchiamento. Lo scopo di questo progetto era di esplorare la correlazione tra alterazione dei livelli enzimatici, squilibrio metabolico e produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) con danno mitocondriale, degenerazione cellulare e invecchiamento. Le MAO umane sono bersagli neurologici validati e molti studi si basano sullo sviluppo di inibitori selettivi sia della MAO-A che della MAO-B. In collaborazione con il Prof. Stanislav Gobec dell'Università di Lubiana (Slovenia) e il suo team, abbiamo studiato una nuova classe di inibitori delle MAO con scaffold generale di 1-propargil-4-stirilpiperidine. Sulla base della stereoisomeria del doppio legame cis / trans abbiamo siamo stati in grado di colpire selettivamente le due isoforme delle MAO. È interessante notare che, mentre gli isomeri cis hanno mostrato selettività MAO-A, gli analoghi trans erano potenti inibitori MAO-B. Il meccanismo di reazione di questi composti è stato studiato mediante analisi cinetica, misurazioni dello spettro UV-Vis e cristallografia a raggi X. Questo studio rappresenta un caso unico di attività stereoselettiva di isomeri cis / trans in grado di discriminare tra isoforme enzimatiche strutturalmente correlate. Il Diphenylene iodonium (DPI) è un potente inibitore di un gran numero di eme e flavoenzimi, ampiamente utilizzati negli esperimenti cellulari come sonda per i processi dipendenti dai ROS. Nel nostro laboratorio, abbiamo eseguito un'analisi strutturale e biochimica di DPI con MAO-A e MAO-B, poiché questi enzimi svolgono un ruolo attivo nei sistemi che generano ROS. Abbiamo dimostrato che DPI è un inibitore reversibile e competitivo di entrambe le isoforme delle MAO, questi risultati dovrebbero essere attentamente considerati ogni volta che DPI viene utilizzato come modulatore dell’attività dei ROS e dello stress ossidativo.