Biochemical aspects of Neurodegeneration: an overview of Metal-Protein Interaction

Neurodegenerative disorders, as Alzheimer's and Parkinson's diseases, are characterized by the presence of deposits of misfolded proteins besides the accumulation of redox active metal ions, as copper or iron, that are implicateci in the uncontrolled generation of reactive oxygen (ROS) and nitrogen (RNS) species. When these products attach neuroproteins, such as -amyloid (A ), a­ synuclein (aSyn) and prion (PrP) proteins, the resulting oxidative modifications of protein backbone lead to significant conformational changes, altering biological functions of the protein and affecting its aggregation state. On the other hand, the redox cycling of metal ion and their interaction with neuronal proteins together with the structural features of protein scaffolds are strongly influenced by the chemical properties of the medium, as the presence of phospholipids. Indeed, aSyn, A and PrP sequences are able to strongly interact with lipid assembly. For instance, the interaction between a-synuclein and neuronal phospholipids induces the protein fibrillation, involving the lipid interaction site in the N-terminal region of the protein in which high affinity binding sites for copper were identified, so affecting the redox reactivity of the resulting complexes. The quenching of the redox cycle of the metal when bound to aSyn N-terminus and upon its trapping in membrane was also observed in the presence of prion fragment 76-114, partially encompassing the octarepeat domain, that is generally accepted as the main binding site for copper(II) ions, and an adjacent sequence outside the octarepeat, in which copper(I) can be easily accommodated by the coordination of two vicinal methionines. Moreover, PrP protein is normally bound to neuronal membrane via its glycophosphatidylinositol tail and, upon the binding between the protein and phospholipids, the structural conversion from cellular PrP into misfolded isoform (PrP 5c) is detected. Similar effect on the protein folding was identified when -amyloid 1-42 fragments interactwith membrane layers, inducingan enhancement ofthe rate of oligomerization and amyloid plaques generation. In addition to the previously-described context, the high content of catecholamines, as dopamine, in neuronal compartments and their susceptibility to give oxidative products prone to aggregate in melanic structures can exacerbate the neurodegenerative condition. The aim of this first project was therefore the characterization of the redox ability of copper bound A , a-synuclein and prion sequences promoted by the presence of catechols and bound to a membrane-mimetic environment (micelles of sodium dodecylsulfate), together with the study of structural features of the complexes and of the oxidative modifications on protein/peptide scaffolds. The results mainly show that the redox capability of copper complexes with prion fragments and aSyn protein is quenched when anchored to the micelle, in which Cu(I)-adduct trapped by SDS is totally unreactive to dioxygen. On the other hand, copper-A complexes are not internalized in micelles and their interaction with SDS only partially reduce the oxidative reaction toward catechol.

I disturbi neurodegenerativi, come Alzheimer e Parkinson, sono caratterizzati dalla presenza di depositi di proteine non correttamente strutturate oltre all'accumulo di ioni metallici redox-attivi, quali rame e ferro, che sono implicati nella generazione incontrollata di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e dell'azoto (RNS). Quando questi prodotti attaccano proteine neuronali, come -amiloide (A ), a-sinucleina (aSyn) e prioni (PrP), le risultanti modificazioni ossidative a carico del backbone proteico causano un significativo cambiamento conformazionale, il quale altera il ruolo biologico della proteina ed influenza il suo stato di aggregazione. D'altra parte, le proprietà chimiche dell'ambiente, come la presenza di fosfolipidi, influenzano significativamente sia il ciclo redox dello ione metallico e la sua interazione con proteine neuronali sia le caratteristiche strutturali degli scheletri proteici. Infatti, aSyn, A e PrP sono in grado di interagire saldamente con assembramenti lipidici. Per esempio, l'interazione tra a-sinucleina e fosfolipidi neuronali induce fibrillazione proteica, coinvolgendo il sito di interazione lipidica contenuto nella regione N-terminale della proteina in cui sono stati identificati anche i siti di binding ad alta affinità per il rame, quindi influenzando la reattività redox dei risultanti complessi. Lo spegnimento della reattività redox del metallo legato alla porzione N-terminale di aSyn seguito dal suo intrappolamento in membrana è stato anche osservato in presenza del frammento prionico 76-114, in quale comprende parzialmente il dominio di ottaripetizione, che viene generalmente riconosciuto come il sito di binding principale per il rame (II), e una sequenza adiacente ad esso ed esterna all'ottaripetizione, in cui il rame(I) può essere facilmente legato mediante coordinazione di due metionine vicine. Inoltre, la proteina PrP è normalmente legata alla membrana neuronale attraverso la coda di glicofosfatidilinositolo e, in seguito al legame tra proteina e fosfolipidi, si rileva un cambiamento strutturale da PrP cellulare a isoforma non correttamente faldata (PrP 5c). Un effetto simile sulla conformazione della proteina è stato identificato in seguito all'interazione di frammenti amiloidi 1-42 con la membrana, il quale causa un aumento nella velocità di oligomerizzazione e della generazione di placche amiloidi. In aggiunta al contesto precedentemente descritto, l'alto contenuto di catecolamine nei compartimenti neuronali, come la dopamina, e la loro suscettibilità a dare prodotti ossidativi soggetti ad aggregare in strutture melaniche può aggravare la condizione di neurodegenerazione. Lo scopo di questo primo progetto è quindi la caratterizzazione della reattività redox del rame legato a sequenze prioniche, di a-sinucleina e di -amiloide, promossa da catecoli e in presenza di un ambiente che mimi la membrana (micelle di sodio dodecilsolfato), in aggiunta allo studio delle caratteristiche strutturali dei complessi e delle modifiche ossidative a carico degli scheletri proteici/peptidici. I risultati indicano principalmente che la capacità redox dei complessi di rame con frammenti prionici e con la proteina aSyn viene totalmente spenta se legati alle micelle, in cui gli addotti di Cu(I) intrappolati dall'SDS sono totalmente privi di reattività verso l'ossigeno. D'altra parte, i complessi rame-A non vengono internalizzati nelle micelle e la loro interazione con l'SDS riduce solo parzialmente la reazione di ossidazione dei catecoli. Infine, si evidenzia un deciso spegnimento della capacità ossidativa del complesso ternario rame-PrP-A una volta inserito in membrana, mentre si osserva un notevole aumento di reattività rispetto ai rispettivi addotti binari se in presenza del solo ambiente acquoso.