ALS-linked FUS mutation reduces DNA Damage Response activation through RNF168 signalling pathway

Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a neurodegenerative diseases characterized by the progressive degeneration of upper and lower motor neurons and it is associated with the progressive paralysis of almost all skeletal muscles leading to death within 3-5 years from the diagnosis. One ALS-linked gene is Fused in Sarcoma (FUS) that encodes for a DNA/RNA binding protein also involved in DNA repair. Common pathological hallmarks in ALS are cytoplasmic neuronal inclusions containing FUS protein in a mutated form. In this regards, the ALS-linked mutation FUS-P525L leads to a severe juvenile onset and immunohistochemistry performed on tissues from ALS patients carrying this mutation reveal that the mutant FUS protein accumulate into cytoplasmic inclusions (CI). ALS neurons have been shown to accumulate oxidative DNA damage and DNA breaks, hazardous events that healthy cells efficiently counteract by activating a set of molecular mechanisms known as DNA-Damage response (DDR). The activation of this pathway is cytologically detectable at single cell level in the form of nuclear DDR foci, multiprotein complexes at site of damage. My PhD project aims to understand whether mutant FUS-P525L recruitment into CI could hinder the efficacy of DDR and DNA repair, progressively leading to DNA damage accumulation. Moreover, FUS P525L mutation has been associated to autophagy impairment and accumulation of the cargo autophagic protein p62. In the context of cancer, p62 interacts with and inhibits the activity of the E3 Ubiquitin ligases RNF168 a key factor in DNA signaling and DNA repair. The results obtained indicate that the induction of mutant FUS CI is per se genotoxic and induce a nuclear wide accumulation of the γH2AX DNA damage marker. Importantly, mutant FUS CI strongly alters DDR signaling as demonstrated by the loss of DDR foci in cells exposed to DNA damage. Concomitantly, we observed that p62 accumulates in the cytoplasm of cells harbouring mutant FUS CI and, unexpectedly, those cells also have reduced nuclear signal of RNF168, which appears in the cytoplasm colocalizing with p62. As a consequence DDR foci are lost. Indeed, we observed that the overexpression of RNF168 or RNF8, another ubiquitin ligase acting upstream of it in DDR, can restore RNF168 nuclear level and DDR foci, thus reducing γH2AX signal in cells with FUS CI. Importantly, same result can be obtained by p62 inactivation, enhancing the survival of cells with CI. These results indicate a novel mechanistic link between FUS CI, mis-regulation of the autophagic pathway and DNA damage signaling. Our data pave the-way to consider DDR alterations triggered by FUS CI as a novel, relevant aspect driving ALS pathogenesis and a new pathway to target in the envision of future therapeutic treatment.

La Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) è una patologia neurodegenerativa caratterizzata dalla progressiva degenerazione dei motoneuroni superiori e inferiori ed è associata con la progressiva paralisi di quasi tutti i muscoli scheletrici portando alla morte entro i 3-5 anni dalla diagnosi. Un gene legato alla SLA è Fused in Sarcoma (FUS) che codifica per una proteina che lega il DNA e RNA ed è anche coinvolta nel riparo al DNA. Un segno distintivo della patologia SLA sono le inclusioni citoplasmatiche neuronali che contengono la proteina FUS nella sua forma mutante. A questo proposito la mutazione legata alla SLA FUS-P525L porta ad un esordio giovanile della malattia e tecniche di immunoistochimica fatta su tessuti di pazienti affetti da SLA che presentano questa mutazione hanno rivelato che la forma mutata della proteina FUS si accumula all’interno di inclusioni citoplasmatiche (CI). E’ stato dimostrato che i neuroni affetti da SLA accumulano danno ossidativo al DNA e anche interruzioni alla sequenza del DNA, i quali rappresentano eventi molto pericolosi che le cellule in salute riparano efficientemente attraverso l’attivazione di un set di meccanismi molecolari conosciuti come risposta al danno del DNA (DDR). L’attivazione di questo meccanismo è visibile a livello citologico e cellulare attraverso la formazione di foci di DDR, definiti come complessi multi proteici presenti ai siti di danno. Il mio dottorato di ricerca ha lo scopo di capire se la forma mutante di FUS-P525L reclutata all’interno di CI può ostacolare l’efficacia del DDR e del riparo al DNA, portando progressivamente all’accumulo di danno al DNA. Inoltre, la mutazione FUS P525L è associata ad un malfunzionamento del meccanismo autofagico e all’accumulo della proteina autofagica p62. Nel contesto del cancro, p62 interagisce e inibisce l’attività della E3 ubiquitina ligasi RNF168 la quale è un fattore chiave nel meccanismo del riparo al DNA. I risultati ottenuti indicano che l’induzione della forma mutante di FUS nei CI è essa stessa genotossica ed induce un accumulo nucleare del marker di danno al DNA γH2AX. Importante, la forma mutante di FUS nei CI altera in maniera significativa il segnale DDR come dimostrato dalla perdita dei foci DDR nelle cellule esposte al danno di DNA. Allo stesso tempo, abbiamo osservato che la proteina p62 si accumula nel citoplasma delle cellule con forma mutante di FUS nei CI e, inaspettatamente, queste cellule hanno anche un ridotto segnale nucleare di RNF168, che appare nel citoplasma e co-localizza con p62. Come conseguenza i foci di DDR sono persi. Infatti abbiamo osservato che l’over espressione di RNF168 e RNF8, un’altra ubiquitina ligasi che agisce prima di RNF168 nel DDR, è in grado di riportare nel RNF168 nel nucleo e la formazione di foci DDR, e questo reduce il segnale nucleare di γH2AX nelle cellule con mutante di FUS nei CI. Degno di nota, gli stessi risultati possono essere ottenuti attraverso l’inattivazione di p62 che aumenta la sopravvivenza delle cellule con la forma mutante di FUS nei CI. Questi risultati indicano un nuovo collegamento meccanicistico tra FUS CI, la deregolazione del flusso autofagico e del segnale DDR. I nostri dati propongono di considerare l’alterazione del meccanismo DDR causata dalla forma mutante di FUS nei CI come un nuovo e rilevante aspetto che guida la patologia SLA e come un nuovo meccanismo su cui agire in vista di nuovi futuri trattamenti terapeutici.